叔丁基锂主要用作锂化试剂、卤-锂交换试剂、环化试剂和强碱等，以制备多种类型的有机化合物。例如：

（1）通过卤素一金属交换反应叔丁基锂可用于制备其它有机铿化合物，如芳基铿、三烷基氢化硼锉、乙烯基锉、a一铿烷基苯硫醚、β一铿代烯胺等。实验室用作聚合引发剂和金属化剂等。叔丁基锂相比正丁基锂和异丁基锂而言，具有更强的碱性和金属化活性以及更弱的亲核性，因此能够用于质子酸性更弱的烃类底物的脱质子锂化反应。通常，简单烷烃对于叔丁基锂仍然能保持惰性，但是对于含杂原子的溶剂如THF则会与叔丁基锂发生反应。当底物是含杂原子如氧、氮、硫的化合物时，使用叔丁基锂作脱质子试剂能够获得很高的区域选择性。如乙烯基醚或环醚与叔丁基锂反应是一种简单制备α-锂化乙烯基醚的方法。
（2）叔丁基锂与其它烷基锂试剂类似，叔丁基锂对含杂原子取代基的芳烃化合物的锂化反应同样具有邻位锂化效应。在锂卤交换反应中，叔丁基锂由于其较弱的亲核性，因而相比正丁基锂和异丁基锂具有更大的优势。其中，锂-碘交换反应进行得最为完全、有效，如先在低温下与6-碘-1-己烯作用发生锂-碘交换，然后升温发生高立体选择性和区域选择性的5-外环化反应，进而被亲电试剂进攻得到官能化产物 (式4)[4]。类似的异构反应也可以用来制备多环化合物。